Biosinteza insulinei se destasoara dupa modelul de acum destul de bine cunoscut al sintezei hormonilor polipeptidici. De altfel, celula [3 dispune de organitclc specifice acestui scop si anume un reticul endoplasmic rugos abundent si granule secretorii. Semnalul inductor (glucoza), actionand la nivelul regiunii promotoare a genei proinsulinei, situata pe bratul lung al cromozomului 11, initiaza sinteza de ARN mesager si transcriptia preproinsulinei (un prohormon cu 110 aminoacizi), care apoi este translatata la nivelul reticulului endoplasmic rugos si scindata in proinsulina. Aceasta la randul ei, este transportata in aparatul Golgi, care are un mediu bogat in Zn si Ca si unde se formeaza granulele de secretie imature. In interiorul acestor granule, pro
insulina este scindata, de catre endopeptidazele legate de membrana. in produsi de scindare succesiva (proinsulina scindata la nivelul aminoacizilor 65, 66 si proinsulina scindata la nivelul aminoacizilor 32, 33, din care apoi sunt indepartati aminoacizii adiacenti locului de scindare), pentru ca in fina! sa ramana insulina si peptidul C (connecting peptide).
Granulele care contin cristale de insulina (hexameri avand in centru un atom de Zn) sunt numite granule mature. Cristalizarea hexamerica a insulinei are probabil scopul de a siliza moleculele si de a stopa actiunea peptidazelor. Aceste granule pot ramane in timentul de depozitare a insulinei, pot fi absorbite in granule mai mari unde insulina este degradata prin crinofagie, sau secretate prin exocitoza. intreg acest proces de biosinteza dureaza aprox. doua orc (din care 5-l0 mm ren transcriptiei si scindarii preproinsulinei in proinsulina, 30 min formarii granulelor secretarii imature si aprox. 60 min scindarii proinsulinei in insulina si peptid C).
Pragul de concentratie al glucozei care stimuleaza sinteza proinsulinei, este mai mic decat cel necesar secretiei insulinei, ceea ce, in conditii fiziologice, prene depletia completa de insulina a celulelor [i (2, 3). Stimularea sintezei de proinsulina de catre glucoza si alti secretagogi depinde de capacitatea celulei B de a genera ATP, iar cuplarea stimulului meolic cu biosinteza este asigurata de cresterea concentratiei intracelulare de K.
Studierea mutatiilor naturale si a celor induse artificial ale moleculei de insulina au contribuit la elucidarea unor aspecte ale biosintezei si actiunii acesteia. Au fost identificate cateva familii in care uni i membrii aveau o mutatie punctiforma in gena insulinei, ceea ce genera molecule de insulina modificate ca structura primara (Val-A3 era inlocuita cu Leu, Phe-B24 inlocuita cu Ser si Phe-B25 inlocuita cu Leu), care au o imunoreactitate practic identica cu insulina normala insa cu o capacitate de legare de receptori mult redusa. Indizii cu aceasta mutatie, transmisa autosomal dominant, au forme usoare de
diabet sau scadere a tolerantei la glucoza. Fiind heterozigoti, acesti pacienti secreta si molecule normale de insulina insa au o hiperinsulinemie edenta datorita remanentei prelungite in circulatie amoleculelor de insulina anormala. A fost de asemenea descrisa la membrii catorva familii cu hiperproinsulinemic asimptomatica o mutatie in molecula de proinsulina (Arg-65 inlocuita cu His) care altereaza procesarea intra Beta-celulara a acesteia (nerecunoasterea locului de clivare a lantului A de peptidul C).
Procesul de biosinteza a insulinei se incheie cu formarea granulelor secretarii mature care contin insulina biologic activa. Fiecare celula p contine aproximativ 13,000 de granule secretorii (4). Calea principala de eliberare a insulinei din celulele p in spatiul interstitial este exocitoza Ca2+ -dependenta a granulelor secretorii. Studii efectuate in ultimul deceniu au reusit sa descifreze mai multe dintre complexele evenimente ale procesului pre- si post-exocitotic in celulele endocrine (5).
Stimulul fiziologic ai secretiei de insulina, glucoza, produce la concentratii in domeniul normalului, oscilatii ale potentialului de membrana intre platouri de dcpolarizare (peste care se suprapun secvente potentiale de actiune) si intervale inactive de repolarizare (6), care sunt consecinta unor oscilatii ale concentratiei intracelulare a Ca2+ si care se materializeaza in secretia pulsatorie a insulinei. Actitatea electrica a celulelor Beta este liniar dependenta de concentratia glucozei si atunci cand aceasta depaseste aprox. 360 mg/dl descarcarea potentialelor de actiune dene practic continua.
La nivelul membranei celulelor {3 au fost identificate cel putin 10-20 de tipuri de canale ionice dintre care cele mai importante in secretia insulinei sunt canalele de K+ - ATP dependente si canalele de Ca2+ dependente de voltaj. Canalele de K+ - ATP dependente sunt spontan deschise la concentratii mici ale glucozei si prin efluxul ionilor poziti de K+ se mentine electronegatitatea intracelulara caracteristica potentialului de repaus. Patrunderea glucozei in celulele Beta, prin intermediul transportorilor GLUT 2 si apoi glicoliza genereaza cresterea concentratiei de ATP (si scaderea celei de ADP) ceea ce arc ca o prima consecinta inchiderea canalelor de K+ - ATP dependente, scaderea electronegatitatii intracelulare, deschiderea canalelor de Ca2+ dependente de voltaj si influxul ionilor de Ca2+ si declansarea dcpolarizarii. ATP-ul actioneaza ca si un blocant al canalelor de K+ in timp ce Mg-ADP produce deschiderea acestora. Celula beta depolarizata mai poate raspunde si la alti stimuli electrogenici cum este arginina care are o molecula puternic electropozitiva si care are un efect minor asupra secretiei de insulina la concentratii mici ale glucozei insa acest efect dene major la concentratii mari ale glucozei, atunci cand canalele de K+ sunt complet inchise. Canalul de K+ (inwardly -rectifying potassium channel) este format din patru subunitati si exista doua tipuri de astfel de canale: Kir 6.1 si Kir 6.2. Primul este prezent in celulele musculare netede vasculare si in astrocite si are caracteristici diferite fata de cel de al doilea, care este prezent in majoritatea celulelor. Fiecare canal de K+ - ATP dependent este asociat cu un receptor pentru sulfonilureice (SUR), structura polipeptidica complexa care face parte din familia transportorilor numiti \"caseta care leaga ATP \" (ATP binding casette ABC).
S-au descris doua tipuri de astfel de receptori: SURI, prezenti in celulele p si a pancreatice, in celulele intestinale care secreta GLP-l si in neuroni si SUR2, cu doua subtipuri SUR2A, prezenti in musculatura scheletica si cardiaca si SUR2B in celulele musculare netede.
Grodsky si col. au demonstrat cu mai mult de 30 de ani in urma (Endocrinolgy, 1968) faptul ca secretia de insulina se desfasoara bifazic, cu o prima faza de secretie rapida (care dureaza 5-l0 min), urmata de o faza de secretie mai lenta insa sustinuta in timp (cateva ore). Faza rapida de secretie poate fi indusa, alaturi de glucoza si de alti stimuii cum sunt sulfonilureicele, insa pentru faza de secretie lenta este necesar un stimul meolic (ex. glucoza, aminoacizi).
Masurarea capacitanlei membranei celulare (direct proportionala cu suprafata acesteia) este metoda care a permis monitorizarea cu o foarte buna rezolutie temporala (aprox. 1 ms) a dinamicii traficului granulelor secretarii (7). Alipirea membranei granulelor secretorii de membrana celulara si deschiderea porului de secretie produce o crestere a suprafetei acesteia din urma si astfel o modificare a capacitantei care poate fi inregistrata. O familie de proteine denumite SNAP (soluble NSF attachement protein, NSF= N-ethylmalcimide sensitive fusion protein), este implicata in fuziunea membranelor. Cele mai importante dintre acestea sunt syntaxina si SNAP-25, apartinand membranei celulare si synaptobrena, care tine de membrana granulelor secretorii. Acestea produc fuziunea membranelor dupa modelul unui fermoar (6). Aceste proteine, alaturi probabil de proteine din familia synaptotagminelor ar putea juca rolul de senzori pentru ionii de Ca2*. Un alt grup de proteine care leaga GTP, proteinele Rab, au de asemenea un rol important in secretie, actionand ca si \"frane\" ale acestui proces (8). In conditii experimentale lipsa acestor proteine produce scaderea tolerantei la glucoza.
Din punct de vedere functionai dar si spatial pool-ul de granule secretarii este format din mai multe timente. Imediat sub membrana celulara sunt situate granulele care constituie timentul gata pregatit pentru secretie (readly-relcasable pool). Aceste granule pot li secretate imediat, fara nicio pregatire (priming) prealabila. Un al doilea timent cuprinde granule situate in apropierea primului (la o distanta de aprox. un diametru al granulelor) care pentru a putea fi secretate necesita \"pregatire\". in timp ce secretia granulelor din primul timent nu necesita consum energetic, exocitoza celor din al doilea timent este ATP-dependenta (6). Proteinele SNARE nu intern numai in fuziunea membranelor ci ele au si importantul rol de a directiona influxul de ioni de Ca2+ spre zonele membranei plasmatice vecine cu granulele secretorii.
Dupa golirea, prin simulare, a timentului \"gata pentru secretie\'\' capacitatea de secretie se resileste treptat pe parcursul a aprox. 1,5 min necesare reumplerii acestuia din timentul imediat vecin (6). Un al treilea timent este format din granulele secretorii situate in citoplasma si care parcurg traseul spre membrana celulara prin miscari saltatorii sau prin difuziune lenta, prin reteaua mierotubulara, in care un rol major il au kinesin-elc ATP-dependente. In conditii experimentale, distrugerea retelei microtubulare cu ncristina produce o reducere cu peste 50% a secretiei de insulina indusa de glucoza (9). Aceasta reducere se coreleaza cu o scadere cu 85% a miscarilor saltatorii ale granulelor (6).
Reglarea meolica a secretiei insulinei de catre glucoza este mediata de modificarile in concentratia K+ in spatiul sub-membranar. Modificarile concentratiei ADP si ATP \"pregatesc\" granulele pentru secretie prin modificarea pH-ului intragranular. Odata produsa exocitoza membranele granulelor secretorii sunt endocitatc printr-un proces mediat de clathrin.
Relevanta pentru diabet aprocesclor mai sus sumarizate este intens evaluata la ora actuala. Perturbari in glicoliza sau in meolismul oxidativ ar putea induce modificari ale concentratiei dianamice a ADP si ATP. Polimorfismul genelor care codifica canalele de Ca2\" sau alte proteine care participa la exocitoza ar putea fi diabetogen. Polimorlismul unei singure nucleotide din gena care codifica syntaxina s-a dovedit a se asocia cu varsta de debut si necesarul de insulina la pacientii cu diabet tip 2 (10). Nu in ultimul rand acizii grasi liberi, ai caror concentratie in sangele portal este crescuta la pacientii cu diabet si/sau
obezitate si/sau sindrom meolic, exercita de asemenea efecte complexe asupra secretiei de insulina. Prezenta unui aport de acizi grasi liberi este necesara pentru secretia normala a insulinei. O crestere rapida a concentratiei acestora amplifica secretia de insulina indusa de glucoza, prin cresterea concentratiei de acil-CoA si stimularea unor enzime care intern in exocitoza. Expunerea cronica la concentratii crescute de acizi grasi liberi, produce acelasi efect dar prin intermediul obezitatii se reduce efectul stimulator al glucozei. Cresterea concentratiei de cAMP are efect incretinic prin stimularea, a lipaza hormono-sensibila din celulele B, lipolizei.
